小鼠ES細胞(小鼠胚胎細胞)的分離方法基本成熟，且已廣泛應用于生命科學研究的各個領域。1981年Evans**分離得到小鼠ES細胞，他以手術切除受精后2.5 d小鼠卵巢并結合注射干擾環境，從而使胚胎延遲著床，再回收胚胎，將其體外培養于STO細胞飼養層上，結果得到了小鼠ES細胞系。Martin G R以外科法剝離小鼠囊胚滋養層細胞，得到內細胞團(ICM)并將其置于STO細胞飼養層上，培養基為小鼠PSA-1 ES細胞條件培養基，結果也得到小鼠ES細胞。此后，Axelord等用微滴法得到小鼠ES細胞系；Kaufman等用單倍體延遲著床小鼠囊胚建立同源二倍體ES細胞系；Wobus等**用原代小鼠成纖維細胞作飼養層建立了小鼠ES細胞系；Smith等**使用大鼠肝細胞條件培養基作為分化抑制物建立了小鼠ES細胞系。Brook F A等進一步完善了小鼠ES細胞的分離方法，以致從許多品系小鼠包括近交系和突變系，都可獲得ES細胞。分離小鼠ES細胞并非只能從囊胚，也并非必須依賴飼養層細胞。Dhhaise等將52枚8-細胞小鼠胚胎消化成單個分裂球并培養于小鼠原代成纖維細胞(小鼠胚胎細胞)飼養層上，所用培養基為DMEM/F12，并添加100 mL/L的胎牛血清、100 mL/L的新生犢牛血清和0.1 mmol/L的2-巰基乙醇，5天后，出現多個干細胞集落，消化傳代后建立了一個ES細胞系MSB1。將MSB1注入SCID(severe combined immunodeficient mice)小鼠，能產生包含三胚層分化物的畸胎瘤，注入52枚囊胚產生了2個活的個體(1雄，1雌)，但雄性個體無生殖能力。Tojo等用同樣方法從雜交小鼠(C57BL/6×DBA/2)8-細胞胚也得到了ES細胞。小鼠ES細胞具有無限增殖的自我更新能力。Suda Y等將小鼠ES細胞傳250代以上沒有出現轉化的跡象，它們仍具有正常的二倍體核型；在生殖系嵌合體中能產生正常的配子；作為核供體能重組克隆胚胎。上述結果表明小鼠ES細胞是永生的。
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