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PCR
技術(shù)支持

DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：植物組織制備基因組DNA實(shí)驗(yàn)


標(biāo)簽： 植物組織 基因 DNA

利用基因組DNA較長(zhǎng)的特性，可以將其與細(xì)胞器或質(zhì)粒等小分子DNA分離。在提取過(guò)程中，染色體會(huì)發(fā)生機(jī)械斷裂，產(chǎn)生大小不同的片段，因此分離基因組DNA時(shí)應(yīng)盡量在溫和的條件下操作，如盡量減少酚/氯仿抽提、混勻過(guò)程要輕緩， 以保證得到較長(zhǎng)的DNA。

實(shí)驗(yàn)方法
  • 氯化銫法
  • CTAB法
實(shí)驗(yàn)方法原理 加入一定量的異丙醇或乙醇，基因組的大分子DNA即沉淀形成纖維狀絮團(tuán)飄浮其中， 可用玻棒將其取出，而小分子DNA則只形成顆粒狀沉淀附于壁上及底部， 從而達(dá)到提取的目的。
實(shí)驗(yàn)材料
試劑、試劑盒
儀器、耗材
實(shí)驗(yàn)步驟
1.  收取10~50 g 新鮮的植物組織。
 
2.  植物組織用冷的無(wú)菌水洗滌、吸干，放人液氮中凍結(jié)，用研缽和研杵研成細(xì)粉。
3.  將凍結(jié)的細(xì)粉放入250 ml 的離心瓶中，立即加入抽提緩沖液約每克植物5~10 ml，輕輕攪拌混勻。
4.  加入十二烷基肌氨酸鈉使終濃度達(dá)1%，于溫育1~2 h。
 
5.  用JA-14轉(zhuǎn)子4℃，5 500 g 離心10min 保留上清，必要時(shí)重復(fù)此歩驟以除去殘?jiān)?br> 6.  加人0.6體積異丙醇，混合，如果看不見(jiàn)沉淀，于-20℃放置30 min，用JA-14轉(zhuǎn)子4℃，7 500 g 離心15 min，棄上清。
7.  沉淀用9 ml TE緩沖液重懸，加入9.7 g 固體氯化銫，混勻，冰上放置30 min，用JA-14轉(zhuǎn)子，7 500 g 離心10 min，保留上清。
 
8.  加入0.5 ml 10 mg/ml 的溴化乙錠，冰上放置30 min，4℃ 7500 g  離心10min.
9.  將上清轉(zhuǎn)入兩個(gè)5 ml 的快封超離心管中，并封口。
10.  用VTi80轉(zhuǎn)子20℃ 525 000 g 離心4 h，或20℃，300 000 g 離心過(guò)夜，用15號(hào)針頭和注射器收集帶。
11.  用氯化艷飽和的異丙醇重復(fù)抽提DNA以除去溴化乙錠。
 
12.  加入2體積水和6體積100%乙醇，混勻，-20℃放置1 h，用JA-20或JA-21轉(zhuǎn)子4℃，7500 g 離心10 min。
 
13.  沉淀用TE緩沖液重懸，加入1/10體積的3 mol/l 乙酸鈉和2體積的100%乙酵重懸，重復(fù)離心。
14.  沉淀晾干后用TE緩沖液重懸
                                                                                    合肥合肥星肽生物科技有限公司

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